ELISA夾心法實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)

　　以下是天正信達(dá)ELISA夾心法實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的詳細(xì)說明：

　　一、實(shí)驗(yàn)步驟?

　　抗體包被?

　　用pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被過夜(或37℃ 2小時(shí))。

　　棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液(含0.1%吐溫的PBS)洗板3次，每次3分鐘，拍干。

　　封閉?

　　加入3% BSA或5%脫脂牛奶的封閉液200μl/孔，37℃孵育1小時(shí)，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

　　洗板3次，方法同前。

　　加樣與孵育?

　　加入待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)(復(fù)雜樣本可延長(zhǎng)至2小時(shí))。

　　設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔和陽性對(duì)照孔。

　　酶標(biāo)抗體結(jié)合?

　　洗板后加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)。

　　洗板5次，去除未結(jié)合抗體。

　　顯色與終止?

　　加入TMB底物溶液100μl/孔，避光反應(yīng)15-30分鐘(觀察顯色程度)。

　　加入50μl 2Mls終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)變黃。

　　檢測(cè)?

　　終止后15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值(參考波長(zhǎng)630nm)。

　　二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)?

　　樣本處理?

　　血清樣本需離心去除纖維蛋白，避免溶血;組織勻漿需充分裂解后離心取上清。

　　NaN3會(huì)抑制HRP活性，避免使用含NaN3的樣本或緩沖液。

　　溫度控制?

　　所有試劑使用前需平衡至室溫(20-25℃)，避免溫度差異導(dǎo)致反應(yīng)速率不均。

　　孵育時(shí)用不干膠密封板孔，防止蒸發(fā)。

　　洗滌操作?

　　手工洗板需垂直拍板，避免交叉污染;自動(dòng)洗板機(jī)需檢查洗液管路是否堵塞。

　　洗滌后立即加下一步試劑，避免孔板干燥。

　　質(zhì)量控制?

　　陽性對(duì)照OD值應(yīng)≥0.8，陰性對(duì)照OD值≤0.2，否則實(shí)驗(yàn)無效。

　　建議做雙復(fù)孔，減少操作誤差。

　　試劑保存?

　　未開封試劑盒2-8℃保存;濃縮洗滌液結(jié)晶需37℃溶解后使用。

　　TMB底物需避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　三、常見問題解決?

　　高本底值?：檢查封閉是否充分，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或更換封閉劑(如改用5%脫脂牛奶)。

　　顯色過弱?：確認(rèn)酶標(biāo)抗體活性及孵育時(shí)間，避免顯色底物失效。

　　孔間差異大?：校準(zhǔn)移液器，加樣時(shí)避免氣泡或孔壁殘留。

　　如需具體試劑盒參數(shù)，請(qǐng)參照產(chǎn)品說明書。

　　注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)，具體請(qǐng)咨詢技術(shù)老師。

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